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姚永刚团队证实CRISPR/Cas9体系可以编辑线粒体DNA
2022-10-26 来源:疾病机理遗传学与进化医学学科组 作者:
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  线粒体是细胞的能量代谢枢纽和信号转导交汇站,其功能异常往往会影响高耗能的组织器官(如神经和肌肉组织),也与其他细胞功能如抗病毒效应等密切相关。线粒体DNAmitochondrial DNA, mtDNA)是线粒体中独立于核基因组的一套遗传物质。mtDNA突变被发现与包括神经退行性疾病、耳聋、肌肉萎缩等多种疾病相关,目前这类线粒体突变导致的疾病在治疗方面充满挑战。 

  随着基因编辑技术的发展,通过CRISPR/Cas9、单碱基编辑等技术,可实现核基因的高效编辑。多个研究团队研发了线粒体靶向定位的DNA酶(如TALEN、ZFN等),可以改变胞内mtDNA突变异质性的比例。近期研发的mtDNA单碱基编辑体系,也在细胞层次,以及动物和植物体内实现了mtDNA突变的单碱基编辑。由于单碱基编辑体系会改变同一编辑窗口中的其他碱基,导致编辑的精准性不足;同时,现有的mtDNA编辑技术,仅局限于修饰一定类型的基因突变,针对颠换、插入和缺失等类型的mtDNA基因变异,目前尚无解决方案。这些问题,限制了相关基因编辑技术在线粒体疾病动物模型建:突蛑瘟频确矫娴挠τ。CRISPR/Cas9技术有望克服这些局限性。线粒体靶向的CRISPR/Cas9体系在近期研究中被报道可实现mtDNA的编辑,但这些研究都是基于基因扩增(PCR)的方式,来间接验证mtDNA分子是否被编辑。这一方法不能排除鉴定得到的被编辑的mtDNA分子来源于假阳性扩增,这也是为何关于CRISPR/Cas9技术能否编辑mtDNA仍然备受争议。 

  来自姚永刚团队的毕蕊博士等人,通过在Cas9蛋白上游融合线粒体引导肽,下游配置线粒体基因的3'-端非编码(3'-UTR)序列,优化建立了靶向线粒体的CRISPR/Cas9体系mito-Cas9。该体系转染细胞后,可以实现Cas9蛋白和相应的引导RNAsgRNA)靶向线粒体的转运。研究人员在该体系中引入了包含6个碱基“GAATTC”插入的单链DNAssODN)同源重组模板,通过PacBioNanopore两种三代测序技术,对经mito-Cas9体系编辑的细胞提取的mtDNA分子进行直接建库和测序,在获得的mtDNA分子全长序列中,发现部分mtDNA基因组中含有精准插入的“GAATTC”。由于在他们采用的三代测序过程中,没有PCR扩增环节,因此,这一结果为mtDNA可以被CRISPR/Cas9体系编辑,提供了最直接的实验证据。进一步研究发现,介导同源重组修复的关键蛋白RAD51可显著提升mito-Cas9体系的基因编辑效率。采用以上mtDNA编辑体系,他们在HEK293T细胞中成功引入了mtDNA的致病变异m.3902_3908inv,这提示mito-Cas9体系在建立线粒体疾病细胞模型中具有一定的应用价值。 

  线粒体DNA的高效基因编辑是领域内关注的热点和难题。该研究解决了一直以来围绕“CRISPR/Cas9体系是否可以编辑mtDNA”这一问题的争议。虽然目前mito-Cas9体系对mtDNA的编辑效率还很低,离临床基因治疗预期差距甚远,但基于CRISPR/Cas9对比其他基因编辑技术的一些优势,如可编辑更多种类的突变类型、编辑精准性高等,值得后续进行深入的探索和优化,以提升mito-Cas9体系对mtDNA的编辑效率,为未来线粒体相关疾病建:突蛑瘟铺峁┕ぞ。 

  相关研究结果近期发表于The innovation期刊(论文链接:https://www.cell.com/the-innovation/fulltext/S2666-6758(22)00125-4),毕蕊副研究员和姚永刚研究员为本文的共同通讯作者。毕蕊副研究员、徐敏副研究员和博士研究生李余为本文的共同第一作者。该研究工作得到上海科技大学黄行许教授、香港中文大学赵晖教授和易发体育郑萍研究员的大力支持。 

  该工作得到科技部、中国科学院、国家自然科学基金委和云南省的项目支持。 

 

  1. 利用mito-Cas9基因编辑体系实现mtDNA编辑 


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